SUMMARY
Isolation and identification of active substance wich attachEscherichia coli K99 bacteria on the surface of the zona pellucida embryo is important to be conducted to prevent embryos contamination. For that popuses a laboratory study on the attachment of E. coli K99 on the zona pellucida of mouse embryos was carried out by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and scanning electron microscopy (SEM). The zona pelucida of mouse embryo was separated from embryo by embryo hatching and sonification. The separated zona pellucida was then used antigen for ELISA. Suspension of several different Escherichia coli isolates with or without K99 antigen was prepared in PBS. K99 villous antigen was prepared by heating of the bacterial suspension at 60oC for I hour, and followed by centrifugation. Embryos with an intact zana pelucida were inoculated with E. coli at the dose of 105cells per ml and incubated for 1 hour at 37oC. After 3 times washes with PBS, the embryos were examined by scanning electron microscope. The result showed that the ELISA readings (optical density) of samples with K99 antigen was significantly higher than those without K99 antigen (K88 and F41). The attachment of E. Coli to the plate coated with zona pellcida was observed only in the well containing K99 antigen, but not in the well containing K88 or F41 antigen. The attachment of K99 bacterial cells was also observed by SEM. This study provide a clear evidence for the specific attachment between E. coli K99 and the zona pellucida of mouse embryo. As we know, the E.coli K99 specifically attach to mannose, so the active substance on the surface of the zona pellucida was mannose. Key words: ELISA, SEM, zona pellucida, E.coliK99, mannose
Isolation and identification of active substance wich attachEscherichia coli K99 bacteria on the surface of the zona pellucida embryo is important to be conducted to prevent embryos contamination. For that popuses a laboratory study on the attachment of E. coli K99 on the zona pellucida of mouse embryos was carried out by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and scanning electron microscopy (SEM). The zona pelucida of mouse embryo was separated from embryo by embryo hatching and sonification. The separated zona pellucida was then used antigen for ELISA. Suspension of several different Escherichia coli isolates with or without K99 antigen was prepared in PBS. K99 villous antigen was prepared by heating of the bacterial suspension at 60oC for I hour, and followed by centrifugation. Embryos with an intact zana pelucida were inoculated with E. coli at the dose of 105cells per ml and incubated for 1 hour at 37oC. After 3 times washes with PBS, the embryos were examined by scanning electron microscope. The result showed that the ELISA readings (optical density) of samples with K99 antigen was significantly higher than those without K99 antigen (K88 and F41). The attachment of E. Coli to the plate coated with zona pellcida was observed only in the well containing K99 antigen, but not in the well containing K88 or F41 antigen. The attachment of K99 bacterial cells was also observed by SEM. This study provide a clear evidence for the specific attachment between E. coli K99 and the zona pellucida of mouse embryo. As we know, the E.coli K99 specifically attach to mannose, so the active substance on the surface of the zona pellucida was mannose. Key words: ELISA, SEM, zona pellucida, E.coliK99, mannose
RINGKASAN
Isolasi dan identifikasi bahan aktif yang merekatkan bakteri E.coli K99 ke permukaan zona pelusida perlu dilakukan untuk mencegah pencemaran. Untuk itu telah dilakukan penelitian laboratoris tentang perlekatan E.coli K99 pada zona pelusida mencit. Sampai kini belum ada informasi mengenai perlekatan antara E.coli K99 dengan zona pelusida yang dilacak menggunakan ELISA dan SEM. Uji ELISA dipersiapkan guna melacak perlekatan ini. Untuk itu, zona pelusida mencit dipisahkan, setelah embrio hatching dan selanjutnya disonikasi. Zona pelusida yang telah disonikasi dipandang sebagai antigen dan digunakan untuk melapisi sumuran cawan ELISA. Suspensi E.coli dalam PBS, baik bakteri yang memiliki K99 mau pun yang tidak, dipersiapkan dari sel-sel bakteri utuh yang berasal dari isolat yang berbeda. Antigen pili K99 dipersiapkan dengan pemanasan suspensi E.coli K99 pada suhu 600C selama satu jam. Pili K99 diperoleh dengan melakukan sentrifyus. Embrio yang memiliki zona pelusida utuh dicemari dengan bakteri E.coli K99 sebanyak 105 per ml, diinkubasikan selama satu jam pada suhu 370C. Selanjutnya embrio yang tercemar itu dicuci dengan mPBS dan dipersiapkan untuk pemeriksaan mikroskop electron. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa kepadatan optik sample-sampel yang mengandung antigen K99, angkanya lebih tinggi dibandingkan dengan yang tidak (K88 dan F41). Dalam penelitian ini ditemukan adanya perlekatan antara antigen K99 dengan zona pelusida pada sumuran yang dilapisi dengan zona pelusida, dan tidak dengan K88 dan F41. Hal ini berarti bahwa terjadi perlekatan antara antigen K99 dengan zona pelusida. Dengan SEM, bakteri E.coli K99 terlacak melekat pada permukaan embrio. Kesimpulan yang dapat ditarik dari penelitian ini bahwa terjadi perlekatan yang spesifik antara E.coli K99 dengan zona pelusida, yang ditunjukkan antara pili K99 dengan ekstrak zona pelusida. Diketahui bakteri E.coli K99 mampu melekat ke manosa. Maka unsur reseptor E.coli K99 pada zona pelusida adalah gula manosa. Kata-kata kunci : ELISA, SEM, zona pelusida, E.coli K99, manosa
Isolasi dan identifikasi bahan aktif yang merekatkan bakteri E.coli K99 ke permukaan zona pelusida perlu dilakukan untuk mencegah pencemaran. Untuk itu telah dilakukan penelitian laboratoris tentang perlekatan E.coli K99 pada zona pelusida mencit. Sampai kini belum ada informasi mengenai perlekatan antara E.coli K99 dengan zona pelusida yang dilacak menggunakan ELISA dan SEM. Uji ELISA dipersiapkan guna melacak perlekatan ini. Untuk itu, zona pelusida mencit dipisahkan, setelah embrio hatching dan selanjutnya disonikasi. Zona pelusida yang telah disonikasi dipandang sebagai antigen dan digunakan untuk melapisi sumuran cawan ELISA. Suspensi E.coli dalam PBS, baik bakteri yang memiliki K99 mau pun yang tidak, dipersiapkan dari sel-sel bakteri utuh yang berasal dari isolat yang berbeda. Antigen pili K99 dipersiapkan dengan pemanasan suspensi E.coli K99 pada suhu 600C selama satu jam. Pili K99 diperoleh dengan melakukan sentrifyus. Embrio yang memiliki zona pelusida utuh dicemari dengan bakteri E.coli K99 sebanyak 105 per ml, diinkubasikan selama satu jam pada suhu 370C. Selanjutnya embrio yang tercemar itu dicuci dengan mPBS dan dipersiapkan untuk pemeriksaan mikroskop electron. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa kepadatan optik sample-sampel yang mengandung antigen K99, angkanya lebih tinggi dibandingkan dengan yang tidak (K88 dan F41). Dalam penelitian ini ditemukan adanya perlekatan antara antigen K99 dengan zona pelusida pada sumuran yang dilapisi dengan zona pelusida, dan tidak dengan K88 dan F41. Hal ini berarti bahwa terjadi perlekatan antara antigen K99 dengan zona pelusida. Dengan SEM, bakteri E.coli K99 terlacak melekat pada permukaan embrio. Kesimpulan yang dapat ditarik dari penelitian ini bahwa terjadi perlekatan yang spesifik antara E.coli K99 dengan zona pelusida, yang ditunjukkan antara pili K99 dengan ekstrak zona pelusida. Diketahui bakteri E.coli K99 mampu melekat ke manosa. Maka unsur reseptor E.coli K99 pada zona pelusida adalah gula manosa. Kata-kata kunci : ELISA, SEM, zona pelusida, E.coli K99, manosa
No comments:
Post a Comment